非洲豬瘟作為養(yǎng)豬業(yè)的重大威脅，其快速準(zhǔn)確檢測至關(guān)重要。PCR熒光檢測儀憑借其高靈敏度和特異性，成為防控非洲豬瘟疫情的關(guān)鍵工具。有些用戶在使用非洲豬瘟檢測儀時常會遇到一些問題，今天來給大家解答并講講需要注意的事項。

一、樣本采集與處理

Q1：如何確保樣本采集的規(guī)范性？

• 無菌操作：使用一次性真空采血管，采樣部位需酒精消毒后采集，避免樣本污染。

• 采樣部位：優(yōu)選耳緣靜脈血（抗凝管）、腹股溝淋巴結(jié)或扁桃體組織，確保樣本代表性。

• 冷鏈運(yùn)輸：樣本需4℃保存，24小時內(nèi)送達(dá)實驗室，防止核酸降解。

Q2：樣本處理中有哪些污染防控措施？

• 環(huán)境控制：在BSL-2實驗室操作，使用超凈工作臺或生物安全柜。

• 試劑準(zhǔn)備：試劑平衡至室溫后使用，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致效價下降。

• 陰性對照：每批次設(shè)置3個陰性對照，監(jiān)測實驗室污染。

二、檢測操作規(guī)范

Q3：PCR反應(yīng)體系構(gòu)建需注意哪些細(xì)節(jié)？

• 加樣順序：模板RNA→預(yù)混液→酶→探針，避免氣泡產(chǎn)生。

• 分裝要求：使用8聯(lián)管分裝，每孔總體積20μL，確保反應(yīng)均一性。

• 陽性對照：設(shè)置強(qiáng)弱陽性對照（1×103、1×10?、1×10?拷貝/μL），驗證檢測效能。

Q4：擴(kuò)增程序設(shè)置的關(guān)鍵參數(shù)有哪些？

• 預(yù)變性：95℃ 5min，激活Taq酶。

• 循環(huán)參數(shù)：95℃ 15s（變性）→60℃ 45s（退火延伸），40個循環(huán)。

• 熔解曲線：60℃→95℃（升溫速率0.5℃/s），驗證產(chǎn)物特異性。

三、結(jié)果判讀與異常處理

Q5：如何解讀擴(kuò)增曲線和Ct值？

• 陽性標(biāo)準(zhǔn)：Ct值≤35，且呈典型S型擴(kuò)增曲線。

• 可疑樣本：Ct值35-40需復(fù)檢，建議改用巢式PCR驗證。

• 陰性結(jié)果：需排除采樣不當(dāng)或樣本保存問題。

Q6：檢測結(jié)果出現(xiàn)“翹尾”現(xiàn)象如何處理？

• 初步處理：復(fù)查原有樣本，重新提取核酸驗證。

• 深入排查：若仍出現(xiàn)“翹尾”，需做環(huán)境樣本和陰性對照，排除實驗室污染。

• 臨床驗證：結(jié)合病豬臨床癥狀，必要時重新采樣復(fù)查。

四、實驗室管理要點

Q7：如何防止實驗室污染？

• 單向操作流：試劑準(zhǔn)備區(qū)→樣本處理區(qū)→擴(kuò)增區(qū)（氣壓遞減）。

• 耗材處理：使用無核酸酶槍頭，經(jīng)UV照射后使用。

• 環(huán)境消毒：實驗后使用專用核酸祛除劑消毒臺面和設(shè)備。

Q8：儀器維護(hù)與校準(zhǔn)有哪些要求？

• 定期校準(zhǔn)：每日進(jìn)行熒光本底檢測，每周進(jìn)行溫度驗證。

• 軟件升級：定期更新分析算法和軟件補(bǔ)丁，提升檢測精度。

• 記錄保存：詳細(xì)記錄實驗條件、試劑批號、操作者等信息，確保結(jié)果可追溯。

五、特殊場景應(yīng)對策略

Q9：環(huán)境樣本檢測不出內(nèi)標(biāo)的原因？

• 技術(shù)原理：非洲豬瘟試劑檢測豬內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)，環(huán)境樣本可能不含豬源細(xì)胞。

• 偶發(fā)檢出：可能因環(huán)境樣本黏附豬源性細(xì)胞，需結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查綜合判斷。

Q10：檢測結(jié)果與臨床診斷不符如何處理？

• 系統(tǒng)分析：考慮“窗口期”、取樣部位、送檢時間等因素。

• 方法驗證：采用不同試劑復(fù)檢，或結(jié)合ELISA、生物學(xué)檢測方法綜合判斷。

• 動態(tài)監(jiān)測：對可疑豬群進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測，觀察病毒載量變化趨勢。

通過嚴(yán)格執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，結(jié)合質(zhì)量控制措施，可確保非洲豬瘟PCR熒光檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。建議實驗室定期參加能力驗證，持續(xù)提升檢測水平，為非洲豬瘟防控提供堅實的技術(shù)支撐。

TH-H480熒光定量PCR非洲豬瘟檢測儀

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